LKB1 Plasmide di attivazione CRISPR (r): sc-437297-ACT

LKB1 (nota anche come STK11) codifica una chinasi serina/treonina che agisce da regolatore principale dell’omeostasi energetica cellulare, attivando le chinasi della famiglia AMPK e coordinando le risposte allo stress metabolico. Nelle cellule di ratto, LKB1 integra segnali di nutrienti e di polarità per influenzare il metabolismo mitocondriale, l’autofagia e il mantenimento della polarità epiteliale attraverso vie che includono la segnalazione AMPK–mTOR. La sua attività incide sulla progressione del ciclo cellulare e sulla sopravvivenza in condizioni di bassa energia, collegando lo stato di LKB1 a fenotipi caratterizzati da un controllo della crescita alterato e da adattamento metabolico. La disregolazione delle reti di segnalazione associate a LKB1 è ampiamente studiata in contesti di omeostasi tissutale, infiammazione e trasformazione oncogena, in cui risultano alterati i programmi di rilevamento dell’energia e di polarità.

LKB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

LKB1 Il plasmide di attivazione CRISPR (r) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione , dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di LKB1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da LKB1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via LKB1 nelle cellule tumorali con espressione di silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.