Lamin A Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400039-ACT

LMNA codifica la lamina A, una proteina a filamenti intermedi di tipo V che polimerizza con la lamina C per formare la lamina nucleare e sostenere l’integrità dell’involucro nucleare. La lamina A regola l’organizzazione della cromatina, la stabilità del genoma e la meccanotrasduzione, accoppiando il nucleoscheletro al citoscheletro tramite il complesso LINC e influenzando così i programmi trascrizionali e le risposte al danno del DNA. È coinvolta in processi quali la funzione dei pori nucleari, il riassemblaggio nucleare in mitosi e il posizionamento dei domini associati alla lamina (LAD), che nel loro insieme contribuiscono a determinare il destino cellulare e la segnalazione in risposta allo stress. La deregolazione di LMNA è associata alle laminopatie che colpiscono tessuti muscolari, adiposi e cardiaci, ed è frequentemente studiata per il suo ruolo in fenotipi di invecchiamento precoce, difetti della morfologia nucleare e alterazioni dell’espressione genica.

Lamin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di LMNA senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Lamin A Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus LMNA nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione LMNA, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Lamin A. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus LMNA nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Lamin A nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Lamin A nelle cellule tumorali con espressione di LMNA silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.