IP3KC Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-408964-ACT

ITPKC codifica l’inositolo-trifosfato 3-chinasi C (IP3KC), un enzima che fosforila l’inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3) per generare IP4, modulando così la mobilizzazione di Ca2+ dai depositi intracellulari dipendente da IP3. Modellando la dinamica del Ca2+ citosolico, IP3KC influenza le cascate di segnalazione a valle che collegano i flussi di secondi messaggeri a programmi trascrizionali, incluse vie associate all’attivazione dei linfociti e, più in generale, alla segnalazione immunitaria. Un’attività alterata di ITPKC è stata associata a risposte Ca2+-dipendenti disregolate e a fenotipi infiammatori, rendendolo rilevante per studi meccanicistici sull’integrazione dei segnali e sulla funzione delle cellule immunitarie. Come nodo nel metabolismo dei fosfoinositidi e nella segnalazione del Ca2+, IP3KC è frequentemente studiata in contesti in cui si analizzano la trascrizione dipendente dallo stimolo e le soglie di attivazione cellulare.

IP3KC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ITPKC senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IP3KC Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ITPKC nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ITPKC, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IP3KC. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ITPKC nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IP3KC nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IP3KC nelle cellule tumorali con espressione di ITPKC silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.