IFT20 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-418576-ACT

IFT20 (intraflagellar transport 20) codifica una componente centrale del macchinario di trasporto intraflagellare di tipo B, che supporta l’assemblaggio e il mantenimento del ciglio primario, coordinando il traffico di proteine di membrana e di segnalazione necessarie per la ciliogenesi. Oltre al suo ruolo ciliare, IFT20 si localizza al Golgi e partecipa allo smistamento vescicolare e al trasporto polarizzato, collegando le dinamiche della via secretoria agli output di segnalazione dipendenti dal ciglio. Attraverso queste funzioni, IFT20 influenza vie comunemente organizzate a livello del ciglio primario, tra cui Hedgehog e altre cascate di segnalazione mediate da recettori che regolano proliferazione e differenziamento. Un’attività deregolata di IFT20 è stata associata a fenotipi cellulari legati alle ciglia, rilevanti per la biologia delle ciliopatie, e a difetti più ampi nella segnalazione cellulare e nell’omeostasi tissutale.

IFT20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di IFT20 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

IFT20 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus IFT20 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione IFT20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di IFT20. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus IFT20 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da IFT20 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via IFT20 nelle cellule tumorali con espressione di IFT20 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.