HXK II Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420866-ACT

Il gene murino Hk2 codifica l’esochinasi II (HXK II), un enzima limitante la velocità che fosforila il glucosio a glucosio-6-fosfato nel punto d’ingresso della glicolisi, controllando così il flusso di carbonio verso la produzione di energia e le vie biosintetiche. La funzione di HXK II collega l’utilizzo del glucosio al metabolismo mitocondriale e può influenzare l’equilibrio tra glicolisi e fosforilazione ossidativa, con effetti a valle sulla generazione di ATP, sull’omeostasi redox e sulla disponibilità di precursori anabolici. In molti tipi cellulari, l’espressione di HK2 è regolata da reti di segnalazione sensibili ai nutrienti e ai fattori di crescita, tra cui PI3K–AKT e programmi dipendenti da HIF che coordinano l’adattamento metabolico. Alterazioni dell’attività e dell’espressione di HK2 sono ampiamente utilizzate come indicatori di riprogrammazione metabolica rilevante per stati proliferativi e di adattamento allo stress in modelli di infiammazione, neurodegenerazione e biologia tumorale.

HXK II Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hk2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HXK II Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hk2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hk2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HXK II. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hk2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HXK II nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HXK II nelle cellule tumorali con espressione di Hk2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.