Hus1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403287-ACT

Il gene umano **HUS1** codifica Hus1, un componente fondamentale della pinza di checkpoint **9-1-1** (RAD9A–RAD1–HUS1), che viene caricata sul DNA danneggiato per coordinare la sorveglianza del genoma. Questo complesso promuove la segnalazione dipendente da ATR, supporta la stabilizzazione delle forcelle di replicazione e facilita la scelta delle vie di riparazione del DNA tramite interazioni con mediatori come **TOPBP1** e molteplici fattori di riparazione. Collegando il rilevamento del danno al DNA al controllo dei checkpoint del ciclo cellulare, Hus1 contribuisce a limitare l’instabilità genomica associata alla replicazione. La disregolazione dei processi di checkpoint 9-1-1/ATR è spesso studiata nel contesto del carico mutazionale, dei fenotipi di instabilità cromosomica e dei difetti della risposta al danno del DNA rilevanti per la biologia del cancro e per disordini ereditari della manutenzione del genoma.

Hus1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HUS1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hus1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HUS1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HUS1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hus1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HUS1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hus1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hus1 nelle cellule tumorali con espressione di HUS1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.