hnRNP M Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401670-ACT

HNRNPM codifica la ribonucleoproteina nucleare eterogenea M (hnRNP M), una proteina legante l’RNA che si associa ai trascritti nascenti per regolare l’elaborazione del pre-mRNA, lo splicing alternativo e la maturazione dell’mRNA. hnRNP M partecipa al metabolismo dell’RNA correlato allo spliceosoma e influenza la selezione delle isoforme trascrizionali, che può incidere su programmi dello stato cellulare quali proliferazione, differenziamento ed espressione genica adattativa allo stress. La disregolazione delle reti di splicing dipendenti da HNRNPM è stata collegata a un’alterata transizione epitelio–mesenchimale e a firme aberranti di processamento dell’RNA osservate in molteplici contesti patologici, rendendolo un nodo utile per studiare le conseguenze a livello di via della perturbazione dei fattori di splicing. La modulazione sperimentale dei livelli di hnRNP M può aiutare a mappare eventi di switching di isoforme, dipendenze delle interazioni RNA–proteina e cambiamenti di segnalazione a valle guidati dal rimodellamento del trascrittoma.

hnRNP M Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HNRNPM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

hnRNP M Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HNRNPM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HNRNPM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di hnRNP M. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HNRNPM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da hnRNP M nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via hnRNP M nelle cellule tumorali con espressione di HNRNPM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.