HLF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404752-ACT

HLF (hepatic leukemia factor) umano codifica un fattore di trascrizione PAR bZIP che si lega a elementi regolatori del DNA per controllare programmi genici coinvolti nella differenziazione cellulare, nella trascrizione associata ai ritmi circadiani e nell’espressione di geni responsivi allo stress. HLF partecipa a reti trascrizionali che definiscono l’identità delle linee ematopoietiche e la tempistica dello sviluppo, con effetti a valle sul controllo del ciclo cellulare e sulle vie di sopravvivenza. Una deregolazione dell’espressione di HLF è stata associata ad alterazioni degli stati ematopoietici e a una riprogrammazione trascrizionale oncogenica in contesti rilevanti per la leucemia, rendendolo un nodo utile per studiare fenotipi guidati da fattori di trascrizione. In quanto regolatore nucleare, HLF viene comunemente studiato per il suo impatto sull’attività di promotori/enhancer, sui circuiti di regolazione genica e sulla plasticità trascrizionale specifica di linea.

HLF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HLF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HLF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HLF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HLF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HLF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HLF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HLF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HLF nelle cellule tumorali con espressione di HLF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.