HJURP Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405278-ACT

HJURP (proteina di riconoscimento delle giunzioni di Holliday) è uno chaperone istonico centromerico essenziale per la corretta segregazione dei cromosomi. Media la deposizione e il mantenimento della variante istonica H3 CENP-A ai centromeri, coordinando l’assemblaggio del cinetocore e la progressione mitotica nell’ambito dei processi centrali del centromero/cinetocore e del mantenimento della cromatina accoppiato alla replicazione del DNA. Grazie al suo ruolo nel preservare l’identità del centromero e la stabilità del genoma, l’alterazione dell’espressione o della funzione di HJURP è spesso studiata nel contesto di stress replicativo, aneuploidia e programmi trascrizionali associati alla proliferazione. Queste caratteristiche rendono HJURP un bersaglio utile per indagare la fedeltà mitotica, la dinamica della cromatina e fenotipi del ciclo cellulare rilevanti per il cancro in modelli cellulari umani.

HJURP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HJURP senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HJURP Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HJURP nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HJURP, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HJURP. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HJURP nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HJURP nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HJURP nelle cellule tumorali con espressione di HJURP silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.