HIF1a Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400036-ACT

HIF1A codifica il fattore inducibile dall’ipossia 1 alfa (HIF1a), un fattore di trascrizione sensibile all’ossigeno che coordina l’adattamento cellulare a basse tensioni di ossigeno. Una volta stabilizzato, HIF1a dimerizza con ARNT (HIF-1β) e si lega agli elementi di risposta all’ipossia per regolare geni che controllano glicolisi, segnalazione angiogenica, eritropoiesi, omeostasi del pH e sopravvivenza cellulare. Questo programma di sensing dell’ossigeno interagisce con la segnalazione PI3K–AKT–mTOR, con il metabolismo mitocondriale e con le vie redox, plasmando gli stati infiammatori e delle cellule immunitarie, oltre al rimodellamento dello stroma. Un’attività di HIF1A deregolata è associata alle risposte al danno ischemico, all’infiammazione cronica e alla biologia del microambiente tumorale, rendendolo un nodo centrale per studi meccanicistici dei fenotipi guidati dall’ipossia.

HIF1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HIF1A senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HIF1a Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HIF1A nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HIF1A, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HIF1a. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HIF1A nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HIF1a nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HIF1a nelle cellule tumorali con espressione di HIF1A silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.