HGF Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400433-ACT

Il fattore di crescita degli epatociti (HGF) è una citochina pleiotropica secreta che segnala principalmente attraverso il recettore tirosin-chinasico MET per regolare le interazioni epitelio–mesenchimali, la sopravvivenza cellulare, la proliferazione, la motilità e la morfogenesi ramificata. L’attivazione di HGF–MET coinvolge a valle le vie di segnalazione PI3K–AKT, RAS–MAPK, STAT e quelle delle adesioni focali, integrando segnali che modellano la riparazione e il rimodellamento tissutale. L’espressione deregolata di HGF o l’iperattivazione della via sono spesso studiate nell’invasione tumorale, nelle metastasi, nell’angiogenesi e nel crosstalk stroma–tumore, così come in microambienti fibrotici e infiammatori. In quanto modulatore dipendente dal contesto della plasticità cellulare, HGF è ampiamente utilizzato per indagare la segnalazione paracrina e i fenotipi guidati dal microambiente in modelli cellulari umani.

HGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HGF senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HGF Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HGF nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HGF, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HGF. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HGF nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HGF nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HGF nelle cellule tumorali con espressione di HGF silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.