HFE Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420841-ACT

Il gene murino **Hfe** codifica **HFE**, una proteina di superficie cellulare simile alle molecole MHC di classe I, che si associa alla **β2-microglobulina** e regola l’assorbimento del ferro mediato dal **recettore della transferrina**, modulando così l’omeostasi del ferro a livello intracellulare e sistemico. Attraverso la modulazione del rilevamento e del traffico del ferro, HFE influenza vie legate all’immagazzinamento nella **ferritina**, alla regolazione dell’asse della **epcidina** e alle risposte allo **stress ossidativo**. Un’alterata attività di **Hfe** può perturbare la distribuzione del ferro e favorire un danno cellulare ferro-dipendente, rendendolo rilevante per studi sulla gestione del ferro nel fegato e nei macrofagi, sull’eritropoiesi e sul rimodellamento metabolico associato all’infiammazione. Nei modelli murini, **Hfe** viene spesso analizzato nel contesto di fenotipi di sovraccarico di ferro e dei conseguenti programmi di stress tissutale.

HFE Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Hfe senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

HFE Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Hfe nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Hfe, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di HFE. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Hfe nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da HFE nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via HFE nelle cellule tumorali con espressione di Hfe silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.