Hex Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403827-ACT

L’HHEX umano codifica Hex, un fattore di trascrizione homeobox che regola la specificazione delle linee cellulari e l’organogenesi, con ruoli di primo piano nella precoce definizione dei pattern dell’endoderma, nello sviluppo ematopoietico e nella biologia vascolare. Hex coordina programmi trascrizionali che controllano le decisioni sul destino cellulare, la proliferazione e la differenziazione attraverso il legame al DNA sequenza-specifico e l’interazione con complessi coregolatori. Nei tessuti adulti, HHEX contribuisce al mantenimento dell’omeostasi immunitaria e metabolica, e un’espressione deregolata è stata collegata ad alterazioni della differenziazione ematopoietica e a stati trascrizionali oncogenici. Studi genetici e di espressione associano inoltre HHEX a tratti cardiometabolici, supportandone l’impiego come nodo meccanicistico nella ricerca su vie endocrine e infiammatorie.

Hex Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HHEX senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Hex Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HHEX nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HHEX, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Hex. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HHEX nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Hex nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Hex nelle cellule tumorali con espressione di HHEX silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.