Herc2 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-405015-ACT

HERC2 codifica per la ligasi E3 dell’ubiquitina Herc2 umana, una grande ligasi dell’ubiquitina con dominio HECT che coordina la proteostasi e la segnalazione dipendenti dall’ubiquitina. Herc2 partecipa alle reti di risposta al danno del DNA e a processi associati alla cromatina, contribuendo a modulare il turnover proteico e la localizzazione di regolatori chiave coinvolti nella stabilità del genoma, nella progressione del ciclo cellulare e nella segnalazione da stress. Attraverso l’ubiquitinazione e funzioni di tipo scaffold, HERC2 influenza vie legate allo stress replicativo e alla riparazione; inoltre, un’alterata attività di HERC2 è stata associata a fenotipi neuroevolutivi ereditari e a difetti di mantenimento del genoma rilevanti in ambito oncologico. Queste proprietà rendono HERC2 un bersaglio utile per studiare la regolazione della via dell’ubiquitina, il crosstalk tra le vie di riparazione del DNA e le relazioni genotipo–fenotipo in modelli cellulari umani.

Herc2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di HERC2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Herc2 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus HERC2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione HERC2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Herc2. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus HERC2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Herc2 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Herc2 nelle cellule tumorali con espressione di HERC2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.