GRIF-1 Plasmide di attivazione CRISPR (m2): sc-427813-ACT-2

Il gene murino Trak2 codifica GRIF-1, un adattatore di traffico intracellulare che collega i carichi ai motori chinesinici per sostenere il trasporto a lunga distanza, dipendente dai microtubuli, di organelli e vescicole, con ruoli di primo piano nei compartimenti neuronali e sinaptici. GRIF-1 contribuisce al posizionamento dei mitocondri e di altri carichi lungo assoni e dendriti, influenzando la distribuzione dell’energia, la gestione del calcio e la segnalazione dipendente dall’attività all’interno di vie che regolano il mantenimento dei neuriti e la funzione sinaptica. L’alterazione del trasporto mediato da TRAK2 è associata a fenotipi cellulari rilevanti per la neurodegenerazione e le disfunzioni del neurosviluppo, in cui la compromissione della dinamica degli organelli e del traffico assonale contribuisce alla vulnerabilità neuronale. Gli strumenti di ricerca su Trak2/GRIF-1 consentono studi meccanicistici del trasporto intracellulare, della motilità mitocondriale e del traffico di carichi specifici dei neuroni, inclusa l’analisi delle vie di segnalazione in modelli genetici e in saggi basati su cellule.

GRIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Trak2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GRIF-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (m2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Trak2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Trak2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GRIF-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Trak2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GRIF-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GRIF-1 nelle cellule tumorali con espressione di Trak2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.