GPR91 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403394-ACT

SUCNR1 codifica il recettore umano del succinato GPR91, un GPCR sensibile ai metaboliti che collega l’aumento del succinato extracellulare a programmi di segnalazione a valle, inclusi i pathway MAPK/ERK e quelli calcio-dipendenti. L’attivazione di GPR91 integra lo stato metabolico cellulare con le risposte infiammatorie e allo stress, influenzando il comportamento delle cellule vascolari e immunitarie e modulando la segnalazione di citochine e chemochine. Un’alterata segnalazione succinato–SUCNR1 è stata implicata in condizioni associate a ipossia e disfunzione mitocondriale, inclusa la fisiopatologia cardiometabolica e renale, nonché il rimodellamento tissutale e risposte angiogeniche aberranti. Di conseguenza, SUCNR1/GPR91 rappresenta un nodo utile per studiare l’immunometabolismo, la trasduzione del segnale mediata dai GPCR e il sensing del microambiente in sistemi modello umani.

GPR91 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di SUCNR1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR91 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus SUCNR1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione SUCNR1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR91. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus SUCNR1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR91 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR91 nelle cellule tumorali con espressione di SUCNR1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.