GPR50 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402934-ACT

GPR50 codifica un recettore orfano accoppiato a proteine G (GPCR) strettamente imparentato con i recettori della melatonina ed è espresso in modo preferenziale nei tessuti neuroendocrini, dove è implicato nella regolazione della fisiologia circadiana e metabolica. Sebbene non leghi la melatonina con alta affinità, GPR50 può modulare la segnalazione dei GPCR tramite interazioni tra recettori e processi di traffico recettoriale, influenzando vie di secondi messaggeri che determinano l’eccitabilità neuronale e le risposte ormonali. Associazioni riportate collegano varianti di GPR50 o una sua espressione alterata a disturbi dell’umore, fenotipi del sonno e della stagionalità e tratti metabolici, a supporto della sua rilevanza per la ricerca sul SNC e sul bilancio energetico. In quanto proteina di membrana simile a un recettore, GPR50 è anche utilizzato per studiare l’evoluzione dei GPCR, la dimerizzazione recettoriale e la segnalazione dipendente dal contesto in modelli cellulari umani.

GPR50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GPR50 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GPR50 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GPR50 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GPR50, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GPR50. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GPR50 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GPR50 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GPR50 nelle cellule tumorali con espressione di GPR50 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.