GCN1L1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411545-ACT

Il GCN1 umano (GCN1L1) codifica un cofattore associato ai ribosomi che collega lo stress traslazionale alla risposta integrata allo stress, facilitando l’attivazione della chinasi eIF2α GCN2 durante la limitazione di aminoacidi e altri stress nutrizionali correlati. Attraverso questo ruolo, GCN1L1 contribuisce a coordinare l’attenuazione globale della traduzione con programmi di traduzione selettivi che supportano la proteostasi e l’adattamento metabolico. La perturbazione della segnalazione di stress regolata da GCN1L1 può influenzare gli output trascrizionali dipendenti da ATF4, l’autofagia e le decisioni cellulari di sopravvivenza in condizioni di stress proteotossico o di carenza di nutrienti. La disregolazione di queste vie è stata implicata in contesti quali la tolleranza allo stress delle cellule tumorali, difetti di proteostasi associati alla neurodegenerazione e meccanismi di malattie metaboliche, rendendo GCN1L1 un nodo utile per studi mirati sulle vie di segnalazione.

GCN1L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di GCN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

GCN1L1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus GCN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione GCN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di GCN1L1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus GCN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da GCN1L1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via GCN1L1 nelle cellule tumorali con espressione di GCN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.