Furin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400904-ACT

FURIN codifica la furina, una convertasi di proproteine calcio-dipendente che scinde e attiva diversi precursori proteici lungo la via secretoria, tra cui ormoni, fattori di crescita, recettori ed enzimi che modificano la matrice extracellulare. Processando i substrati nel trans-Golgi network, negli endosomi e sulla superficie cellulare, la furina influenza vie che regolano la segnalazione cellulare, la differenziazione, il rimodellamento della matrice extracellulare e la secrezione regolata. Un’attività di FURIN deregolata è stata associata ad alterazioni della proteostasi e a un’attivazione aberrante di assi di segnalazione implicati nella biologia del cancro, nell’infiammazione e nei meccanismi delle malattie infettive. In quanto nodo centrale nella maturazione delle proproteine, la furina è spesso studiata per il suo impatto sulla disponibilità recettore-ligando e sull’ampiezza delle vie a valle in modelli cellulari umani.

Furin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FURIN senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Furin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FURIN nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FURIN, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Furin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FURIN nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Furin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Furin nelle cellule tumorali con espressione di FURIN silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.