FOXN1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401498-ACT

FOXN1 (forkhead box N1) codifica un fattore di trascrizione della famiglia forkhead essenziale per la differenziazione delle cellule epiteliali timiche e per il mantenimento di un microambiente timico funzionale in grado di supportare lo sviluppo delle cellule T. Nei compartimenti epiteliali, FOXN1 regola programmi che controllano la maturazione dei cheratinociti e la specificazione delle linee epiteliali, collegando la trascrizione regolata dalla cromatina all’omeostasi tissutale. Un’alterata attività di FOXN1 è stata associata a fenotipi di immunodeficienza dovuti a una timopoiesi compromessa, nonché a difetti della barriera epiteliale e della differenziazione. In quanto regolatore che definisce la linea cellulare, FOXN1 è ampiamente utilizzato per studiare le reti trascrizionali che governano l’organogenesi del timo, il dialogo epitelio–immunitario e la regolazione genica nello sviluppo.

FOXN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FOXN1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FOXN1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FOXN1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FOXN1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FOXN1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FOXN1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FOXN1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FOXN1 nelle cellule tumorali con espressione di FOXN1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.