FIG4 Particelle di Attivazione Lentivirale (m): sc-430460-LAC

Il gene murino Fig4 codifica la 5-fosfatasi dei fosfoinositidi FIG4, un regolatore chiave dell’omeostasi del fosfatidilinositolo 3,5-bisfosfato sulle membrane endolisosomiali. FIG4 agisce all’interno del complesso PIKfyve–VAC14–FIG4 per coordinare la maturazione degli endosomi, il traffico lisosomiale, l’autofagia e il riciclo di membrana, contribuendo così a definire l’identità degli organelli e le risposte cellulari allo stress. L’alterazione della segnalazione lipidica dipendente da FIG4 compromette le dinamiche endolisosomiali e il mantenimento neuronale, collegando questa via a fenotipi neurodegenerativi e del neurosviluppo nei sistemi modello. Fig4 è quindi ampiamente studiato nei meccanismi di traffico vescicolare, integrità assonale e proteostasi cellulare.

Le particelle di attivazione lentivirale FIG4 (m) rispondono a questa esigenza incapsulando il sistema completo di attivazione trascrizionale del mediatore di attivazione sinergica (SAM) in particelle lentivirali ad alto titolo pronte per la trasduzione, consentendo un'efficiente sovraregolazione di Fig4 in una gamma più ampia di tipi di cellule umane.

Le particelle di attivazione lentivirale FIG4 (m) veicolano tutti i componenti funzionali del sistema del mediatore di attivazione sinergica (SAM) tramite trasduzione lentivirale. Il sistema comprende tre preparati di particelle co-trasdotti nelle cellule bersaglio: uno che codifica per dCas9 cataliticamente inattivo (mutazioni D10A e N863A) fuso al dominio di transattivazione VP64 con un gene di resistenza alla blasticidina; una che codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1 con un gene di resistenza all'igromicina; e una che codifica un sgRNA di 20 nt specifico per il bersaglio fuso a due aptameri di RNA MS2 con un gene di resistenza alla puromicina. A seguito della trasduzione lentivirale e dell'integrazione genomica dei cassetti di espressione, i componenti del SAM vengono espressi in modo stabile e si assemblano nel locus bersaglio all'interno della regione promotrice prossimale a monte del sito di inizio della trascrizione Fig4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo cooperativo per reclutare il machinery trascrizionale endogeno e guidare una sovraregolazione sostenuta dell'espressione endogena di FIG4. L'uso di dCas9 inattivo nei confronti delle nucleasi evita l'introduzione di rotture del DNA a doppio filamento e preserva il locus genomico nativo Fig4 e l'architettura regolatoria.

Il formato lentivirale offre diversi vantaggi pratici: l'integrazione genomica stabile supporta l'attivazione ereditaria attraverso le divisioni cellulari; le preparazioni di particelle ad alto titolo eliminano la necessità di una produzione virale interna; e la compatibilità con tipi di cellule primarie, non in divisione e resistenti alla trasfezione amplia l'accessibilità sperimentale. Il successo della trasduzione può essere confermato e potenziato attraverso una selezione antibiotica tripla utilizzando puromicina, igromicina e blasticidina.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.