FGD3 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-407854-ACT

FGD3 (proteina 3 contenente domini FYVE, RhoGEF e PH) è un fattore di scambio di nucleotidi guaninici (GEF) per Rho che attiva preferenzialmente CDC42 per regolare il rimodellamento del citoscheletro di actina, il traffico di membrana e la migrazione cellulare polarizzata. Accoppiando il riconoscimento dei fosfoinositidi con la segnalazione mediata da piccole GTPasi, FGD3 influenza processi quali la dinamica di lamellipodi/filopodi, l’adesione cellula-cellula e programmi morfogenetici nei tessuti epiteliali. Un’alterata espressione di FGD3 è stata collegata a cambiamenti nel comportamento invasivo e nel potenziale metastatico in diversi contesti tumorali, rendendola un nodo utile per studiare fenotipi guidati dal citoscheletro. La connettività delle sue vie di segnalazione supporta la ricerca sulla segnalazione dipendente da CDC42, sulla regolazione dell’endocitosi e su programmi trascrizionali associati a differenziamento e motilità.

FGD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FGD3 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FGD3 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FGD3 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FGD3, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FGD3. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FGD3 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FGD3 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FGD3 nelle cellule tumorali con espressione di FGD3 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.