FBL10 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403232-ACT

KDM2B (nota anche come FBL10) codifica una demetilasi istonica contenente il dominio JmjC, che svolge un ruolo nella regolazione epigenetica della trascrizione attraverso il rimodellamento della cromatina. La proteina è implicata nella repressione genica associata a Polycomb e nella modulazione dei programmi del ciclo cellulare e di differenziamento tramite il controllo degli stati di metilazione degli istoni a livello dei promotori. Attraverso queste attività, KDM2B/FBL10 influenza il mantenimento della “stemness”, l’impegno di linea e la senescenza cellulare, collegando la sua disregolazione a segnali proliferativi alterati e a reti trascrizionali aberranti. Alterazioni dell’espressione o della funzione di KDM2B sono state riportate in diversi contesti rilevanti per il cancro e in fenotipi dello sviluppo, rendendola un nodo utile per studiare il controllo dell’espressione genica dipendente dalla cromatina.

FBL10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KDM2B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FBL10 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KDM2B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KDM2B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FBL10. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KDM2B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FBL10 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FBL10 nelle cellule tumorali con espressione di KDM2B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.