FAM20B Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-411386-ACT

FAM20B codifica una xilosilchinasi dei glicosaminoglicani (GAG) residente nel Golgi, che fosforila il residuo di xilosio all’interno della regione linker tetrasaccaridica necessaria per la biosintesi dei proteoglicani. Regolando l’inizio e l’allungamento delle catene di eparan solfato e condroitin/dermatan solfato, FAM20B influenza l’organizzazione della matrice extracellulare, l’adesione cellula–matrice e la distribuzione dei fattori di crescita, includendo assi di segnalazione quali FGF, WNT e BMP. Un’alterata omeostasi di proteoglicani/GAG è associata a difetti dello sviluppo scheletrico, dell’integrità del tessuto connettivo e a programmi di segnalazione cellulare deregolati, rilevanti per il rimodellamento del microambiente tumorale. Di conseguenza, FAM20B viene studiato in vie che controllano proliferazione e migrazione dipendenti dalla matrice, nonché la morfogenesi dello sviluppo.

FAM20B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAM20B senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

FAM20B Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAM20B nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAM20B, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di FAM20B. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAM20B nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da FAM20B nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via FAM20B nelle cellule tumorali con espressione di FAM20B silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.