Evi-1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404112-ACT

MECOM codifica il fattore di trascrizione Evi-1, una proteina a dita di zinco che si lega a elementi regolatori del DNA per controllare la specificazione di linea, l’autorinnovamento e i programmi di differenziamento. Evi-1 influenza lo stato della cromatina e le reti trascrizionali coinvolte nell’ematopoiesi e nella definizione dei pattern di sviluppo, con effetti a valle su proliferazione e apoptosi. Un’attività deregolata di MECOM/Evi-1 è associata a un controllo trascrizionale aberrante nella biologia del cancro, in particolare nelle neoplasie ematologiche, ed è implicata anche in fenotipi più ampi legati allo sviluppo e al destino cellulare. Queste proprietà rendono MECOM un nodo rilevante per lo studio dei circuiti trascrizionali, della regolazione epigenetica e del rimodellamento delle vie oncogeniche nelle cellule umane.

Evi-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di MECOM senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Evi-1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus MECOM nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione MECOM, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Evi-1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus MECOM nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Evi-1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Evi-1 nelle cellule tumorali con espressione di MECOM silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.