ETEA Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403730-ACT

FAF2 codifica la proteina ETEA residente nel reticolo endoplasmatico (nota anche come UBXD8), un adattatore con dominio UBX che collega i substrati ubiquitinati all’ATPasi p97/VCP, supportando la degradazione associata al RE (ERAD) e la proteostasi. Coordinando l’estrazione e il turnover di proteine del RE mal ripiegate o regolatorie, ETEA contribuisce all’accoppiamento con la risposta alle proteine non correttamente ripiegate (unfolded protein response), all’organizzazione delle goccioline lipidiche e all’omeostasi metabolica. L’attività di FAF2/ETEA interseca le vie ubiquitina–proteasoma e le dinamiche di contatto RE–gocciolina lipidica, che influenzano la resilienza cellulare allo stress. Un’alterata regolazione dell’ERAD e del metabolismo lipidico è stata associata a stati di stress proteotossico e a disfunzioni metaboliche, rendendo FAF2 un nodo utile per studi meccanicistici in questi contesti.

ETEA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di FAF2 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

ETEA Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus FAF2 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione FAF2, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di ETEA. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus FAF2 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da ETEA nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via ETEA nelle cellule tumorali con espressione di FAF2 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.