EphB4 Plasmide di attivazione CRISPR (m): sc-420201-ACT

Il gene murino **Ephb4** codifica la tirosin-chinasi recettoriale EphB4, un membro del sistema di segnalazione ephrin–Eph che media una comunicazione dipendente dal contatto tra cellule adiacenti. Le interazioni EphB4–ephrin-B2 regolano lo sviluppo e il rimodellamento vascolare, inclusi la specificazione artero-venosa, la migrazione delle cellule endoteliali e i segnali guida durante il patterning dei tessuti. La segnalazione a valle si integra con le dinamiche del citoscheletro e con le vie dell’adesione, coinvolgendo le GTPasi della famiglia Rho, PI3K/AKT, MAPK/ERK e la segnalazione delle adesioni focali, influenzando il posizionamento cellulare e la formazione di confini. Una segnalazione di EphB4 deregolata è stata implicata nell’angiogenesi patologica e in fenotipi vascolari associati ai tumori, rendendola rilevante per studi meccanicistici in biologia del cancro, modelli di sviluppo e ricerche sul microambiente.

EphB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di Ephb4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EphB4 Il plasmide di attivazione CRISPR (m) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus Ephb4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione Ephb4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EphB4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus Ephb4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EphB4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EphB4 nelle cellule tumorali con espressione di Ephb4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.