Enamelin Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-403738-ACT

ENAM codifica a enamelina, uma glicoproteína secretada da matriz extracelular, altamente expressa por ameloblastos durante o desenvolvimento dentário e incorporada à matriz de esmalte em formação. A enamelina participa da biomineralização do esmalte ao regular a nucleação e o crescimento de cristais de hidroxiapatita e ao atuar em coordenação com outras proteínas da matriz do esmalte e proteases do esmalte durante a maturação da matriz. Esses processos se cruzam com vias de organização da matriz extracelular e do metabolismo mineral que controlam a espessura, a dureza e a arquitetura dos prismas do esmalte. Alterações genéticas em ENAM estão fortemente associadas a defeitos hereditários na formação do esmalte, incluindo formas de amelogênese imperfeita, tornando ENAM um modelo útil para estudar relações genótipo–fenótipo na biologia de tecidos mineralizados.

Enamelin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de ENAM sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Enamelin O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus ENAM em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição ENAM, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Enamelin. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus ENAM nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Enamelin no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Enamelin em células tumorais com expressão de ENAM silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.