EBP1 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402177-ACT

PA2G4 codifica la proteina 1 legante ErbB3 (EBP1), un fattore multifunzionale che si lega a RNA e proteine ed è coinvolto nel coordinare programmi trascrizionali e traduzionali che influenzano la progressione del ciclo cellulare e la differenziazione cellulare. EBP1 è associata alla segnalazione dei recettori ErbB e partecipa alla regolazione dell’espressione genica attraverso interazioni con processi legati alla cromatina e ai ribonucleoproteici, con effetti su vie che controllano la proliferazione e le risposte allo stress. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di PA2G4/EBP1 sono state studiate nel contesto delle reti di segnalazione oncogeniche, incluse modifiche degli output trascrizionali responsivi ai fattori di crescita. Queste proprietà rendono PA2G4 un nodo utile per analizzare come i segnali guidati dai recettori si accoppino al controllo dell’espressione genica nelle cellule umane.

EBP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PA2G4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

EBP1 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PA2G4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PA2G4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di EBP1. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PA2G4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da EBP1 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via EBP1 nelle cellule tumorali con espressione di PA2G4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.