Plasmide CRISPR d'Activation (h) Dynamin II: sc-401037-ACT

DNM2 code la dynamine II humaine, une grande GTPase qui catalyse la scission des membranes lors de l’endocytose médiée par la clathrine et d’autres événements de trafic vésiculaire. La dynamine II agit de concert avec le remodelage de l’actine, les protéines à domaine BAR et les complexes adaptateurs pour réguler l’internalisation des récepteurs, le recyclage des vésicules synaptiques et le tri endosomal, modulant ainsi les sorties de signalisation et l’homéostasie membranaire. Par ses fonctions dans la dynamique membranaire, DNM2 influence des processus tels que la cytocinèse et la distribution des organites, reliant le contrôle de l’endocytose à une physiologie cellulaire plus large. Une activité ou une régulation altérée de DNM2 est associée à des phénotypes neuromusculaires et neurodéveloppementaux, et fait fréquemment l’objet d’études pour son impact sur le trafic des récepteurs et la modulation des voies de signalisation en aval.

Dynamin II Le plasmide d'activation CRISPR (h) offre une approche ciblée et non destructive pour réguler à la hausse l'expression endogène de DNM2 sans modifier la séquence d'ADN sous-jacente.

Dynamin II Le plasmide d'activation CRISPR (h) est un système SAM (synergistic activation mediator) à trois plasmides conçu pour une régulation à la hausse hautement efficace et spécifique du locus DNM2 dans des lignées cellulaires humaines. Le système s'articule autour d'une Cas9 catalytiquement inactive (dCas9) portant deux mutations inactivantes (D10A et N863A) qui éliminent l'activité nucléase tout en préservant la liaison à l'ADN. Cette dCas9 est fusionnée à VP64, un puissant activateur transcriptionnel, et est co-exprimée avec un gène de résistance à la blasticidine pour la sélection. Le deuxième plasmide code pour la protéine de fusion MS2-p65-HSF1, un complexe activateur secondaire qui agit de concert avec dCas9-VP64, ainsi qu'un gène de résistance à l'hygromycine. Le troisième plasmide code pour un ARN guide (sgRNA) de 20 nt spécifique de la cible, fusionné à deux aptamères d'ARN MS2 qui recrutent le complexe MS2-p65-HSF1 vers le site d'activation, accompagné d'un gène de résistance à la puromycine. Les trois plasmides sont délivrés dans un rapport massique de 1:1:1 pour une expression équilibrée de tous les composants du système.

Une fois assemblé au locus cible, le complexe SAM se lie à environ 200 pb en amont du site de départ de la transcription DNM2, où VP64, p65 et HSF1 agissent de concert pour recruter la machinerie transcriptionnelle et induire une régulation à la hausse de l'expression endogène de Dynamin II. Contrairement à Cas9, qui possède une activité nucléase, dCas9 n'introduit pas de cassures double brin ni ne modifie la séquence génomique, préservant ainsi le locus DNM2 natif et permettant l'étude des réponses transcriptionnelles dépendantes de Dynamin II au niveau du locus endogène, ce qui en fait un outil précieux pour les études fonctionnelles, l'identification de gènes cibles et la modélisation de la restauration de la voie Dynamin II dans les cellules tumorales présentant une expression de DNM2 silencée ou réduite.

Réservé à la recherche. N'est pas destiné à un usage diagnostique ou thérapeutique.