DOCK 180 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401387-ACT

DOCK1 umano (DOCK 180) è un fattore di scambio dei nucleotidi della guanina atipico che attiva le GTPasi della famiglia Rac per coordinare il rimodellamento del citoscheletro di actina, l’adesione cellulare e la migrazione direzionale. Attraverso nodi di segnalazione a valle di integrine, recettori tirosin-chinasici e recettori delle chemochine, DOCK 180 sostiene processi quali la formazione di lamellipodi, la macropinocitosi e l’inglobamento di cellule apoptotiche. La segnalazione di Rac dipendente da DOCK1 si interfaccia con vie che regolano le transizioni epitelio-mesenchimali, programmi di motilità associati all’invasione e il traffico delle cellule dell’immunità innata. Un’attività o un’espressione deregolata di DOCK1 è stata associata a fenotipi infiammatori e a comportamenti rilevanti per la disseminazione delle cellule tumorali, rendendolo un bersaglio utile per studi meccanicistici in biologia del cancro e in immunologia.

DOCK 180 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DOCK1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DOCK 180 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DOCK1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DOCK1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DOCK 180. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DOCK1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DOCK 180 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DOCK 180 nelle cellule tumorali con espressione di DOCK1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.