Dnmt1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400272-ACT

DNMT1 codifica a DNA (citosina-5)-metiltransferase 1 (Dnmt1), a principal metiltransferase de manutenção, que copia os padrões de metilação de CpG para as fitas de DNA recém-sintetizadas durante a fase S. Por meio de interações com UHRF1, PCNA e a maquinaria de cromatina acoplada à replicação, a Dnmt1 preserva a memória epigenética e sustenta a estabilidade do genoma, o imprinting e a inativação do cromossomo X. A atividade de DNMT1 molda programas transcricionais via crosstalk com modificações de histonas e remodelamento da cromatina, influenciando a identidade e a diferenciação celulares. A desregulação da função de DNMT1 e a metilação aberrante do DNA estão associadas à reprogramação epigenética oncogênica, a respostas alteradas de reparo do DNA e a fenótipos do neurodesenvolvimento, tornando-a um alvo central para estudos mecanísticos da manutenção do epigenoma.

Dnmt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de DNMT1 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Dnmt1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus DNMT1 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição DNMT1, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Dnmt1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus DNMT1 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Dnmt1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Dnmt1 em células tumorais com expressão de DNMT1 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.