DDX15 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403959-ACT

DHX15 (DDX15) codifica un’elicasi dell’RNA ATP-dipendente della famiglia DEAH-box che rimodella i complessi RNA–proteina per supportare lo splicing del pre-mRNA e, più in generale, il metabolismo dell’RNA. Partecipa alla dinamica dello spliceosoma, inclusi il riconoscimento degli introni e le transizioni catalitiche, ed è stata collegata al coordinamento tra trascrizione e processamento dell’RNA. Influenzando l’utilizzo delle isoforme trascrittiche e il controllo qualità dell’RNA, DDX15 può modulare programmi di espressione genica che regolano la progressione del ciclo cellulare e le risposte allo stress. Uno splicing dell’RNA deregolato e un’attività elicasi alterata sono spesso associati alla trasformazione oncogenica e a fenotipi ematologici e del neurosviluppo, rendendo DHX15 un nodo utile per studi meccanicistici sui difetti di processamento dell’RNA.

DDX15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di DHX15 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DDX15 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus DHX15 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione DHX15, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DDX15. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus DHX15 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DDX15 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DDX15 nelle cellule tumorali con espressione di DHX15 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.