DD4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403692-ACT

L’AKR1C4 umano codifica DD4, una aldo-cheto reduttasi NADPH-dipendente che catalizza la riduzione degli ormoni steroidei e di substrati carbonilici reattivi. DD4 svolge un ruolo di primo piano nel metabolismo epatico degli steroidi e degli acidi biliari, contribuendo alla detossificazione e all’omeostasi redox attraverso la regolazione dell’interconversione dei chetosteroidi. Modulando i livelli di androgeni, progestinici e altri intermedi steroidei, AKR1C4 influenza programmi trascrizionali dipendenti dagli ormoni e reti di segnalazione metabolica. Alterazioni dell’espressione o dell’attività di AKR1C4 sono state associate a una disregolazione del metabolismo steroideo e a condizioni patologiche epatiche, a supporto della sua rilevanza negli studi sulla biologia delle malattie metaboliche e sulla risposta agli xenobiotici.

DD4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di AKR1C4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

DD4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus AKR1C4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione AKR1C4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di DD4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus AKR1C4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da DD4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via DD4 nelle cellule tumorali con espressione di AKR1C4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.