Cytokeratin 7 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400628-ACT

KRT7 codifica la citocheratina 7, una proteina dei filamenti intermedi di tipo II che si assembla con le cheratine di tipo I per formare il citoscheletro delle cheratine negli epiteli semplici. La citocheratina 7 contribuisce all’integrità strutturale, alla polarità e alla resilienza meccanica delle cellule epiteliali, e la sua organizzazione viene rimodellata durante la differenziazione, la risposta alle ferite e la segnalazione da stress. Alterazioni dei pattern di espressione di KRT7 sono ampiamente utilizzate per studiare l’identità di linea epiteliale e la riprogrammazione del citoscheletro in contesti come la caratterizzazione dei sottotipi di carcinoma e la transizione epitelio–mesenchimale. Poiché le reti di cheratine interagiscono con i complessi giunzionali e con il traffico intracellulare, KRT7 è rilevante anche per indagare la funzione di barriera epiteliale e le dinamiche di segnalazione collegate al citoscheletro.

Cytokeratin 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KRT7 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cytokeratin 7 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KRT7 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KRT7, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cytokeratin 7. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KRT7 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cytokeratin 7 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cytokeratin 7 nelle cellule tumorali con espressione di KRT7 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.