cystatin S Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-416501-ACT

CST4 codifica la cistatina S, una cistatina di tipo 2 secreta che agisce come inibitore reversibile delle proteasi cisteiniche “papaina-like”, come le catepsine, contribuendo così a regolare la proteolisi extracellulare e la segnalazione guidata dalle proteasi. È espressa in modo rilevante nella saliva e in altre secrezioni mucosali, dove contribuisce all’omeostasi delle superfici epiteliali modulando la degradazione di proteine, peptidi e componenti della matrice. Modellando l’equilibrio tra proteasi e loro inibitori endogeni, la cistatina S influenza processi legati a infiammazione, integrità della barriera ed ecologia microbica alle interfacce mucosali. L’attività deregolata dell’asse cistatina–catepsina è stata studiata in contesti che includono condizioni infiammatorie del cavo orale e delle vie aeree e il rimodellamento tissutale associato alle proteasi, rendendo CST4 un bersaglio utile per ricerche meccanicistiche sulle reti proteolitiche.

cystatin S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CST4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

cystatin S Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CST4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CST4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di cystatin S. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CST4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da cystatin S nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via cystatin S nelle cellule tumorali con espressione di CST4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.