CYP7A1 Plasmide KO CRISPR/Cas9 (m): sc-419932

Panoramica

Cyp7a1 codifica la colesterolo 7α-idrossilasi (CYP7A1), un enzima del citocromo P450 arricchito nel fegato che catalizza il primo passaggio, limitante la velocità, della via classica di biosintesi degli acidi biliari, convertendo il colesterolo in 7α-idrossicolesterolo. Attraverso la regolazione della dimensione e della composizione del pool di acidi biliari, CYP7A1 collega il catabolismo epatico del colesterolo alla circolazione enteroepatica e alla segnalazione dei recettori nucleari, inclusi il feedback FXR–SHP e il crosstalk con i programmi metabolici di lipidi e glucosio. Un’alterata attività di Cyp7a1 è associata a un’omeostasi del colesterolo compromessa, a cambiamenti nella segnalazione metabolica dipendente dagli acidi biliari e a una maggiore suscettibilità a fenotipi metabolici indotti dalla dieta nei modelli murini. In quanto nodo centrale nella sintesi degli acidi biliari, CYP7A1 è ampiamente studiato nelle vie che regolano la gestione epatica dei lipidi, la comunicazione lungo l’asse intestino–fegato e l’infiammazione metabolica.

CYP7A1 Il plasmide CRISPR/Cas9 KO (m) è un pool di plasmidi progettato per la distruzione mirata del gene Cyp7a1 in mouse linee cellulari. Ogni plasmide del pool co-esprime un sgRNA unico, mirato a un sito distinto all'interno del locus Cyp7a1, insieme alla nucleasi Cas9 di Streptococcus pyogenes, e codifica per la GFP per consentire l'identificazione fluorescente e l'arricchimento delle cellule trasfettate con successo. Questa strategia multi-guida aumenta la probabilità di indurre spostamenti di lettura o delezioni che producono un knockout funzionale, offrendo un'alternativa più robusta agli approcci a guida singola. Le DSB indotte in più siti vengono risolte tramite giunzione non omologa (NHEJ) o, se utilizzate con il modello donatore HDR incluso, tramite riparazione diretta dall'omologia (HDR) in un sito bersaglio definito all'interno del locus.

Se utilizzato in combinazione con il donatore HDR che esprime RFP, la fluorescenza GFP e RFP può essere utilizzata insieme per distinguere le popolazioni cellulari trasfettate da quelle modificate, semplificando i flussi di lavoro di selezione e selezione dei cloni basati sulla citometria a flusso.

Donatore per riparazione diretta dall'omologia (HDR) — Cassetta puromicina con reporter RFP

Per applicazioni che richiedono cloni knockout confermati e selezionabili, il CYP7A1 Plasmide HDR (m) include un costrutto donatore HDR contenente una cassetta di resistenza alla puromicina (PuroR) e un reporter proteina fluorescente rossa (RFP), affiancati da bracci di omologia specifici per un sito bersaglio definito Cyp7a1.
Se cotrasfettato con il CYP7A1 Plasmide CRISPR/Cas9 KO (m):

• La cassetta PuroR-RFP si integra nel sito di taglio di Cas9 tramite HDR, interrompendo il frame di lettura aperto Cyp7a1.
  La fluorescenza RFP fornisce un indicatore visivo immediato dell'integrazione riuscita, consentendo l'identificazione o la selezione basata sulla fluorescenza delle cellule modificate prima o parallelamente alla selezione con puromicina.
  Le cellule modificate con successo vengono confermate attraverso la resistenza alla puromicina, riducendo sostanzialmente il carico di screening dei cloni.
  Questa strategia di selezione è ideale per generare linee cellulari KO clonali stabili per studi funzionali a valle, screening farmacologico o sviluppo di modelli.

Sistema di rimozione della cassetta Cre-lox

Il costrutto donatore HDR presenta siti loxP che fiancheggiano la cassetta di selezione PuroR-RFP per consentire la rimozione pulita del marcatore dopo la conferma del clone. L'espressione transiente della ricombinasi Cre tramite il vettore Cre incluso : sc-418923 elimina la cassetta, lasciando un sito loxP residuo minimo all'interno del locus Cyp7a1 ed eliminando potenziali effetti confondenti sui saggi a valle.
Questo approccio in due fasi:

• Riduce al minimo la perturbazione dell'architettura cromatinica locale e degli elementi regolatori adiacenti
  Ripristina un contesto genomico quasi nativo nel locus modificato
  Consente il riutilizzo della strategia di selezione con puromicina nella stessa linea cellulare per ulteriori modifiche

Caratteristiche principali

• gRNA mirato agli esoni Cyp7a1 critici per la funzione CYP7A1
  Co-espressione di SpCas9 e sgRNA da un singolo plasmide per una somministrazione semplificata
  Donore HDR con resistenza alla puromicina per la selezione positiva dei cloni
  Cassetta PuroR fiancheggiata da loxP con vettore ricombinasi Cre per la rimozione senza soluzione di continuità del marcatore
  Fornito pronto all'uso per la somministrazione tramite trasfezione

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.