cylindromatosis 1 Plasmídeo de ativação de CRISPR (m): sc-428814-ACT

O gene murino **Cyld** codifica a cilindromatose 1, uma enzima desubiquitinante que remove preferencialmente cadeias de ubiquitina ligadas em K63 e M1, atenuando a propagação do sinal a partir de complexos proximais ao recetor. A CYLD atua como regulador negativo da sinalização de NF-κB e MAPK a jusante do recetor de TNF, dos recetores do tipo Toll e das vias do recetor de antigénio, influenciando assim programas transcricionais inflamatórios, a sobrevivência celular e respostas ao stress. Também contribui para a dinâmica do citoesqueleto e para processos dependentes de microtúbulos, moldando a migração celular e a organização dos tecidos. A atividade ou expressão desregulada de CYLD está associada a sinalização imunitária aberrante e à biologia tumoral, tornando-a um alvo valioso para estudar o controlo, dependente de ubiquitina, de redes de sinalização.

cylindromatosis 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de Cyld sem alterar a sequência de ADN subjacente.

cylindromatosis 1 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (m) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus Cyld em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição Cyld, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de cylindromatosis 1. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus Cyld nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de cylindromatosis 1 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via cylindromatosis 1 em células tumorais com expressão de Cyld silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.