Cdk4 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400148-ACT

Il gene umano **CDK4** codifica la chinasi ciclina-dipendente 4 (Cdk4), un regolatore chiave della progressione della fase G1 che si associa alle ciclina di tipo D per fosforilare le proteine della famiglia RB e promuovere la trascrizione dipendente da E2F necessaria per l’ingresso in fase S. L’attività di CDK4 è integrata con le vie di segnalazione mitogeniche, incluse gli assi recettori tirosin-chinasici–RAS–MAPK e PI3K–AKT, ed è modulata da inibitori delle CDK come **CDKN2A** (p16INK4A). Una disregolazione della segnalazione di CDK4 altera il controllo dei checkpoint del ciclo cellulare e contribuisce a programmi proliferativi aberranti rilevanti per la biologia del cancro, influenzando anche le decisioni di linea cellulare e il rimodellamento metabolico nelle cellule in proliferazione. In quanto chinasi nodale all’interno della via ciclina D–CDK4/6–RB, CDK4 rappresenta un bersaglio molecolare ampiamente utilizzato per studiare il controllo della crescita e l’accoppiamento tra ciclo cellulare e trascrizione.

Cdk4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK4 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

Cdk4 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK4 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK4, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di Cdk4. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK4 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da Cdk4 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via Cdk4 nelle cellule tumorali con espressione di CDK4 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.