Cdk4 Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-400148-ACT

O CDK4 humano codifica a quinase dependente de ciclina 4 (Cdk4), um regulador central da progressão na fase G1 que se associa às ciclinas do tipo D para fosforilar proteínas da família RB e promover a transcrição dependente de E2F necessária para a entrada na fase S. A atividade de CDK4 integra-se a vias de sinalização mitogênica, incluindo os eixos receptor tirosina-quinase–RAS–MAPK e PI3K–AKT, e é modulada por inibidores de CDK como o CDKN2A (p16INK4A). A desregulação da sinalização de CDK4 perturba o controle dos checkpoints do ciclo celular e contribui para programas de proliferação aberrantes relevantes para a biologia do câncer, além de influenciar decisões de linhagem e a remodelação metabólica em células em proliferação. Como uma quinase nodal na via ciclina D–CDK4/6–RB, o CDK4 é amplamente utilizado como uma ferramenta molecular para investigar o controle de crescimento e o acoplamento entre ciclo celular e transcrição.

Cdk4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de CDK4 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

Cdk4 O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus CDK4 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição CDK4, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de Cdk4. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus CDK4 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de Cdk4 no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via Cdk4 em células tumorais com expressão de CDK4 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.