CD42d Plasmídeo de ativação de CRISPR (h): sc-404793-ACT

GP5 codifica a glicoproteína plaquetária V (CD42d), um componente do complexo receptor GPIb-IX-V que regula a adesão e a ativação plaquetárias em condições de alto cisalhamento. Por meio de interações com o fator de von Willebrand e de sinalização responsiva à trombina, o CD42d contribui para a hemostasia primária, a remodelação do citoesqueleto e a ativação de integrinas que sustentam a formação de trombos. Alterações na abundância ou na função do complexo GPIb-IX-V estão associadas a fenótipos de disfunção plaquetária e a predisposição a sangramento ou trombose, tornando o GP5 um nó relevante em estudos de biologia vascular e coagulação. Em sistemas experimentais, a expressão de GP5 também pode servir como marcador de programas de linhagem megacariocítica/plaquetária e da montagem do complexo receptor.

CD42d O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) oferece uma abordagem direcionada e não destrutiva para regular positivamente a expressão endógena de GP5 sem alterar a sequência de ADN subjacente.

CD42d O Plasmídeo de Ativação CRISPR (h) é um sistema mediador de ativação sinérgica (SAM) de três plasmídeos, concebido para a regulação positiva transcricional altamente eficiente e específica do locus GP5 em linhas celulares humanas. O sistema é construído em torno de uma Cas9 cataliticamente inativa (dCas9) portadora de duas mutações inativadoras (D10A e N863A) que eliminam a atividade nuclease, preservando simultaneamente a ligação ao ADN. Esta dCas9 é fundida com VP64, um potente ativador transcricional, e é coexpressa com um gene de resistência à blasticidina para seleção. O segundo plasmídeo codifica a proteína de fusão MS2-p65-HSF1, um complexo ativador secundário que atua em conjunto com o dCas9-VP64, juntamente com um gene de resistência à higromicina. O terceiro plasmídeo codifica um sgRNA de 20 nt específico para o alvo, fundido a dois aptâmeros de RNA MS2 que recrutam o complexo MS2-p65-HSF1 para o local de ativação, acompanhado por um gene de resistência à puromicina. Os três plasmídeos são administrados numa proporção de massa de 1:1:1 para uma expressão equilibrada de todos os componentes do sistema.

Uma vez montado no locus alvo, o complexo SAM liga-se a cerca de 200 pb a montante do local de início da transcrição GP5, onde VP64, p65 e HSF1 atuam em conjunto para recrutar a maquinaria transcricional e impulsionar a regulação positiva da expressão endógena de CD42d. Ao contrário da Cas9 com atividade nuclease, o dCas9 não introduz quebras de cadeia dupla nem modifica a sequência genómica, preservando o locus GP5 nativo e permitindo o estudo de respostas transcricionais dependentes de CD42d no locus endógeno, tornando-o uma ferramenta valiosa para estudos funcionais, identificação de genes-alvo e modelagem da restauração da via CD42d em células tumorais com expressão de GP5 silenciada ou reduzida.

Apenas para uso em investigação. Não se destina a uso diagnóstico ou terapêutico.