CD40 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400524-ACT

Il gene CD40 umano codifica un recettore co-stimolatorio della superfamiglia dei recettori del TNF, espresso principalmente sulle cellule presentanti l’antigene, incluse cellule B, cellule dendritiche e macrofagi, dove integra i segnali provenienti da CD40L per modellare l’immunità adattativa. L’ingaggio di CD40 attiva le vie di segnalazione NF-κB canonica e non canonica, le vie MAPK e programmi dipendenti da PI3K/AKT che regolano la presentazione dell’antigene, la produzione di citochine, la sopravvivenza e la proliferazione delle cellule B e la ricombinazione di class switch. Attraverso queste vie, CD40 influenza la dinamica dei centri germinali e le risposte umorali T-dipendenti, e un’attività alterata di CD40 è stata associata a disregolazione immunitaria e patobiologia infiammatoria. Una segnalazione di CD40 disregolata è rilevante anche per l’immunologia dei tumori e per la ricerca sulle neoplasie delle cellule B, dato il suo ruolo negli stati di attivazione cellulare e nella comunicazione con il microambiente.

CD40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD40 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD40 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD40 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD40, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD40. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD40 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD40 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD40 nelle cellule tumorali con espressione di CD40 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.