CD3-ζ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-400591-ACT

CD247 codifica la catena CD3-zeta (CD3ζ), un componente essenziale del complesso recettore dei linfociti T (TCR)–CD3 che contiene motivi di attivazione immunorecettoriali basati su tirosina (ITAM) necessari per la segnalazione guidata dall’antigene. Dopo l’ingaggio del TCR, la fosforilazione di CD3ζ favorisce il reclutamento di ZAP70 e la propagazione del segnale attraverso i signalosomi LAT/SLP-76, attivando a valle le vie MAPK, NF-κB e NFAT, e modulando l’attivazione dei linfociti T, la produzione di citochine e la funzione effettrice citotossica. Un’alterata espressione di CD247 o una ridotta competenza di segnalazione sono state associate a disregolazione immunitaria e a risposte linfocitarie compromesse, inclusa la disfunzione dei linfociti T associata ai tumori e squilibri di segnalazione legati all’autoimmunità. In quanto adattatore prossimale dell’immunità adattativa, CD3ζ è frequentemente studiata nello sviluppo dei linfociti T, nelle soglie di attivazione e nella segnalazione di recettori ingegnerizzati.

CD3-ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD247 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD3-ζ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD247 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD247, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD3-ζ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD247 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD3-ζ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD3-ζ nelle cellule tumorali con espressione di CD247 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.