CD3-δ Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-401519-ACT

CD3D codifica CD3-δ, un componente fondamentale del complesso recettoriale dei linfociti T (TCR)–CD3, necessario per l’attivazione dei linfociti T dipendente dall’antigene e per la propagazione del segnale. CD3-δ partecipa all’assemblaggio e all’espressione in superficie del complesso TCR e trasduce i segnali tramite il suo motivo ITAM citoplasmatico, coinvolgendo LCK/ZAP70 e vie a valle come LAT/SLP-76, PLCγ1–NFAT, NF-κB e MAPK/ERK, per coordinare proliferazione e programmi citochinici. Alterazioni dell’espressione o della funzione di CD3D possono compromettere lo sviluppo dei timociti, la competenza di segnalazione del TCR e l’omeostasi immunitaria, rendendolo rilevante per studi su immunodeficienze, disregolazione immunitaria e interazioni tumore-sistema immunitario. In quanto marcatore di linea definente per i linfociti T, CD3-δ è inoltre ampiamente utilizzato per modellare le soglie di segnalazione del recettore e gli stati di attivazione nelle cellule immunitarie umane.

CD3-δ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CD3D senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CD3-δ Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CD3D nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CD3D, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CD3-δ. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CD3D nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CD3-δ nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CD3-δ nelle cellule tumorali con espressione di CD3D silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.