CCRK Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-409545-ACT

CDK20 codifica per la cell cycle-related kinase (CCRK), una chinasi serina/treonina che regola la progressione del ciclo cellulare e la segnalazione proliferativa attraverso un controllo dipendente dalla fosforilazione delle vie associate alle CDK. CCRK è stata collegata alla modulazione dell’attività Wnt/β-catenina e di programmi trascrizionali più ampi che influenzano crescita, differenziamento e omeostasi cellulare. Un’alterata espressione di CDK20/CCRK è stata riportata in molteplici contesti rilevanti per la patologia, inclusi proliferazione deregolata e cambiamenti nell’equilibrio delle reti di segnalazione nella biologia dei tumori. Di conseguenza, CDK20 è spesso studiato per il suo ruolo nella segnalazione mediata da chinasi, nel controllo del ciclo cellulare e nel crosstalk tra vie di segnalazione nelle cellule umane.

CCRK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CDK20 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCRK Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CDK20 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CDK20, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCRK. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CDK20 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCRK nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCRK nelle cellule tumorali con espressione di CDK20 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.