CCDC111 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-404310-ACT

PRIMPOL (noto anche come CCDC111) codifica PrimPol, una primasi–polimerasi che consente il riavvio della replicazione e la tolleranza al danno del DNA quando le forcelle di replicazione incontrano lesioni o strutture secondarie del DNA. PrimPol supporta il re-priming a valle di forcelle bloccate e contribuisce al riempimento dei gap post-replicativi, collegando la sua attività a vie di mantenimento del genoma che intersecano le risposte allo stress replicativo dipendenti da ATR. Alterazioni della funzione di PRIMPOL sono state associate a un aumento della mutagenesi e a una maggiore sensibilità allo stress genotossico, rendendolo rilevante per studi sulla fedeltà della replicazione e sulle risposte cellulari al danno del DNA endogeno ed esogeno. In quanto enzima nucleare che agisce su forcelle di replicazione sotto stress, PRIMPOL viene spesso esaminato nel contesto dello stress replicativo, della stabilità delle forcelle e del mantenimento dell’integrità cromosomica.

CCDC111 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di PRIMPOL senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CCDC111 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus PRIMPOL nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione PRIMPOL, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CCDC111. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus PRIMPOL nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CCDC111 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CCDC111 nelle cellule tumorali con espressione di PRIMPOL silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.