CatSper Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-403796-ACT

CATSPER1 codifica CatSper, una subunità di un canale del calcio specifico degli spermatozoi, attivato dal pH e dal voltaggio, che contribuisce al complesso CatSper nella membrana del flagello. L’ingresso di Ca2+ mediato da CatSper è un regolatore centrale della motilità iperattivata degli spermatozoi e della segnalazione associata alla capacitazione, integrando l’omeostasi ionica con cambiamenti a valle nel battito flagellare e nell’utilizzo dell’energia. L’alterazione della funzione di CATSPER1 compromette i programmi di motilità dipendenti dal calcio ed è associata a fenotipi di ridotta fertilità maschile, rendendolo un bersaglio chiave per studi meccanicistici della fisiologia degli spermatozoi. Nella ricerca in biologia riproduttiva umana, CATSPER1 viene inoltre utilizzato per studiare come la regolazione dei canali ionici si interfacci con le vie dei secondi messaggeri e con la funzione spermatica in condizioni fisiologiche e di stress.

CatSper Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CATSPER1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CatSper Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CATSPER1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CATSPER1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CatSper. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CATSPER1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CatSper nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CatSper nelle cellule tumorali con espressione di CATSPER1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.