CARD 11 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402770-ACT

CARD11 (CARMA1) codifica una proteina scaffold contenente un dominio di reclutamento delle caspasi, che collega la segnalazione del recettore dell’antigene ai programmi trascrizionali a valle nei linfociti. In seguito all’attivazione del recettore dei linfociti T o dei linfociti B, CARD11 promuove l’assemblaggio del complesso CARD11–BCL10–MALT1 (CBM), consentendo l’attivazione delle vie di NF-κB, JNK e p38 MAPK che controllano proliferazione, produzione di citochine e sopravvivenza. Un’attività deregolata di CARD11 è associata a difetti della segnalazione immunitaria e ad attivazione aberrante dei linfociti, e sono state riportate alterazioni ricorrenti in diversi tumori maligni linfoidi. In quanto hub di segnalazione, CARD11 è spesso studiata per analizzare la segnalazione prossimale del recettore, gli eventi di segnalazione dipendenti dall’ubiquitina e gli esiti trascrizionali nell’immunità adattativa.

CARD 11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di CARD11 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

CARD 11 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus CARD11 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione CARD11, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di CARD 11. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus CARD11 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da CARD 11 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via CARD 11 nelle cellule tumorali con espressione di CARD11 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.