C11orf65 Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-417466-ACT

C11orf65 (chromosome 11 open reading frame 65) codifica una proteina umana ancora poco caratterizzata, annotata come potenziale fattore mitocondriale, con evidenze crescenti che la collegano all’omeostasi dell’organello e alla regolazione bioenergetica. In base alla localizzazione prevista e alla conservazione evolutiva, C11orf65 viene spesso studiato nel contesto dell’espressione genica mitocondriale, del supporto alla fosforilazione ossidativa e delle risposte allo stress cellulare che influenzano la riprogrammazione metabolica. L’alterazione delle vie di mantenimento mitocondriale può modificare la gestione delle specie reattive dell’ossigeno e la sensibilità all’apoptosi, rendendo C11orf65 di interesse negli studi su fenotipi neuromuscolari e metabolici in cui è implicata la disfunzione mitocondriale. Poiché le annotazioni funzionali restano limitate, la modulazione controllata dell’espressione endogena di C11orf65 è utile per mappare le conseguenze trascrizionali e proteomiche a valle.

C11orf65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di C11orf65 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

C11orf65 Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus C11orf65 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione C11orf65, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di C11orf65. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus C11orf65 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da C11orf65 nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via C11orf65 nelle cellule tumorali con espressione di C11orf65 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.