bradykinin Plasmide di attivazione CRISPR (h): sc-402422-ACT

KNG1 codifica il chininogeno ad alto peso molecolare, precursore del mediatore peptidico bradichinina, che viene rilasciata dalle callicreine durante l’attivazione del sistema di contatto plasmatico. La bradichinina segnala principalmente tramite BDKRB1/BDKRB2 per regolare la permeabilità vascolare, il tono della muscolatura liscia, la produzione di ossido nitrico e prostaglandine e le risposte infiammatorie neurogene. Questo asse interseca le cascate della coagulazione e del complemento, collegando il processamento di KNG1 all’emostasi, alla biologia endoteliale e alle reti di segnalazione infiammatoria. Un’attività alterata del sistema chinine–callicreine è stata associata a edema deregolato e a fenotipi infiammatori, rendendo l’asse KNG1/bradichinina un bersaglio comune per studi meccanicistici sull’infiammazione vascolare e su vie correlate.

bradykinin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di KNG1 senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

bradykinin Il plasmide di attivazione CRISPR (h) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus KNG1 nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione KNG1, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di bradykinin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus KNG1 nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da bradykinin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via bradykinin nelle cellule tumorali con espressione di KNG1 silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.