beta Actin Plasmide di attivazione CRISPR (h2): sc-400000-ACT-2

Il gene umano ACTB codifica la beta-actina, una proteina citoscheletrica altamente conservata che polimerizza in microfilamenti per sostenere il mantenimento della forma cellulare, la polarità, la contrattilità e la motilità. La dinamica della beta-actina è centrale nelle vie di rimodellamento del citoscheletro di actina che coordinano il turnover delle adesioni focali, la meccanotrasduzione, la citocinesi e il traffico vescicolare, e contribuisce anche alla regolazione trascrizionale tramite processi nucleari dipendenti dall’actina. L’alterazione di ACTB o delle sue reti di interazione è associata a disturbi dello sviluppo e a modifiche dell’organizzazione citoscheletrica osservate nell’invasione e nella metastatizzazione delle cellule tumorali, evidenziandone il valore per lo studio delle relazioni genotipo–fenotipo. L’editing genetico mirato ad ACTB e i flussi di lavoro di genomica funzionale sono comunemente impiegati per analizzare la segnalazione regolata dall’actina, quantificare fenotipi citoscheletrici mediante imaging di cellule vive e stabilire contesti di riferimento robusti per studi di perturbazione delle vie di segnalazione.

beta Actin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) fornisce un approccio mirato e non distruttivo per sovraregolare l'espressione endogena di ACTB senza alterare la sequenza di DNA sottostante.

beta Actin Il plasmide di attivazione CRISPR (h2) è un sistema SAM (mediatore di attivazione sinergico) a tre plasmidi progettato per la sovraregolazione trascrizionale altamente efficiente e sito-specifica del locus ACTB nelle linee cellulari umane. Il sistema è costruito attorno a una Cas9 cataliticamente inattiva (dCas9) che porta due mutazioni inattivanti (D10A e N863A) che eliminano l'attività nucleasica preservando al contempo il legame con il DNA. Questa dCas9 è fusa con VP64, un potente attivatore trascrizionale, ed è coespressa con un gene di resistenza alla blasticidina per la selezione. Il secondo plasmide codifica la proteina di fusione MS2-p65-HSF1, un complesso attivatore secondario che agisce in sinergia con dCas9-VP64, insieme a un gene di resistenza all'igromicina. Il terzo plasmide codifica un sgRNA specifico per il bersaglio di 20 nt fuso a due aptameri di RNA MS2 che reclutano il complesso MS2-p65-HSF1 nel sito di attivazione, accompagnato da un gene di resistenza alla puromicina. I tre plasmidi vengono somministrati in un rapporto di massa 1:1:1 per un'espressione bilanciata di tutti i componenti del sistema.

Una volta assemblato nel locus bersaglio, il complesso SAM si lega a circa 200 bp a monte del sito di inizio della trascrizione ACTB, dove VP64, p65 e HSF1 agiscono in modo concertato per reclutare il machinery trascrizionale e guidare la sovraregolazione dell'espressione endogena di beta Actin. A differenza della Cas9 con attività nucleasica, dCas9 non introduce rotture a doppio filamento né modifica la sequenza genomica, preservando il locus ACTB nativo e consentendo lo studio delle risposte trascrizionali dipendenti da beta Actin nel locus endogeno, rendendolo uno strumento prezioso per studi funzionali, l'identificazione di geni bersaglio e la modellizzazione del ripristino della via beta Actin nelle cellule tumorali con espressione di ACTB silenziata o ridotta.

Solo per uso di ricerca. Non destinato a uso diagnostico o terapeutico.